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Keywords

Colibacillosis; Virulence genes; Phylogenetic origin

Introducción

Escherichia coli patogénica aviar (APEC) ocasiona una enfermedad respiratoria en aves que generalmente se complica en septicemia, estas cepas comparten factores de virulencia con E. coli causante de enfermedades extraintestinales en humanos y se considera que puede originar una zoonosis [1], bajo esta premisa es importante de analizar estos atributos de patogenicidad.

La capacidad de APEC para causar enfermedad depende de numerosos factores asociados a la patogenicidad como son: serogrupos, adhesinas, sistemas de adquisición de hierro, factores para evadir las defensas del hospedero, toxinas, invasinas entre otros [2]. Entre las adhesinas destacan las fimbrias tipo 1 y P [2,3], así como curli y Tsh que se han relacionado con la colonización del tracto respiratorio [4]. A diferencia de E. coli de biota intestinal, APEC expresa enterobactinas, aerobactinas y yersiniabactinas para la captación y transporte del hierro [5,6]. Adicionalmente, esta bacteria sintetiza proteínas de membrana externa que le permiten resistir al sistema del complemento, entre ellas Iss, Trat y OmpA1 así como aquellas que contribuyen en la formación de biopelículas [7].

Por otra parte, los plásmidos son importantes en la patogenicidad de APEC, entre ellos el pColV que porta genes que codifican para la virulencia y tiene algunos operones con función desconocida así como una gran variedad de elementos móviles [8]. Los genes de virulencia iucA, tsh, iss, iroN y sitA, hlyF, ompT y el operon estABC han sido detectados en diversos plásmidos incluyendo aquellos no colicinogénicos [6,9,10].

El origen filogenético de E. coli se determina en función de la combinación de tres marcadores específicos, los genes yjaA y chuA, además deTspE.4C2 los cuales tienen una relación dicotómica que permite distinguir cuatro grupos filogenéticos designados como A, B1, B2 y D [11], previamente se ha reportado que los aislados causantes de infecciones extraintestinales (ExPEC), incluyendo las infecciones urinarias y la sepsis, derivan principalmente del grupo B2 y en menor proporción del grupo D, mientras que E. coli comensal y patogénica intestinal (IPEC) derivan de los grupos A y B1 [12,13].

El objetivo de este trabajo fue evaluar la presencia de genes de virulencia en aislados APEC, así como determinar el grupo filogenético al que pertenecen.

Material y Metodos

Aislados bacterianos: Se utilizaron 23 aislados APEC obtenidos a partir de órganos parenquimatosos de aves que cursan un cuadro de colisepticemia y que previamente fueron identificados por pruebas bioquímicas.

Extracción de ADN cromosómico: Se realizó de acuerdo a lo descrito por Sambrook y Russell (2001) [14], brevemente, cada aislado se sembró en caldo LB y se incubó 18 h a 37°C en agitación por 18h. Pasado este tiempo 1.5 ml del cultivo se centrifugó a 12,000 rpm por 5 min, el paquete celular se recuperó y se agregaron 300 μl de buffer de lisis (EDTA 0.05 M, NaCl, 0.1 M pH=7.5), se resuspendió y se incubó en baño maría a 80°C por 5 min, luego se adicionaron 20 μl de SDS al 1% y se incubó a 37°C por 30 min. Se agregaron 100 μl de acetato de potasio 5 M y se centrifugó a 12,000 rpm por 3 min. La fase acuosa se transfirió a un tubo y se agregaron 300 μl de isopropanol frío, se centrifugó a 12,000 rpm por 3 min, luego se eliminó el sobrenadante y el botón se lavó con 300 μl de etanol al 70%. Se centrifugó 12,000 rpm por 3 min y el ADN se dejó secar por 15 min y se resuspendió en agua destilada y se guardó a -20°C.

Extracción de ADN plasmídico: Se hizo por el método de lisis alcalina. Cada aislado se inoculó en 5 ml en LB y se incubó por 18 hrs en agitación constante a 37°C. Se centrifugó a 12,000 rpm por 8 min y al paquete celular se agregaron 200 μl de GTE (50 mM Glucosa, Tris-Cl 25 mM pH 8, EDTA 10 mM), se mezcló y se adicionaron 400 μl de NaOH 0.2 M/SDS 1%, nuevamente se mezcló por inversión suavemente cinco veces y se incubó durante 10 min. Posteriormente se agregaron 300 μl de acetato de potasio 5M, se agitó fuertemente y se incubó en hielo por 20 min. Se centrifugó a 12,000 rpm por 20 min y la fase acuosa se transfirió a un tubo en donde se adicionaron dos volúmenes de isopropanol para luego incubar 45 min y centrifugar a 12,000 rpm por 15 min, luego se eliminó el sobrenadante y se dejó secar por 20 min. El ADN se resuspendió en agua destilada y se guardó a -20°C [14].

Detección de los genes de virulencia: Los genes de virulencia a detectar fueron seleccionados considerando su papel en el proceso patogénico y se realizó mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), utilizando oligonucleótidos específicos. Las condiciones de la amplificación fueron las siguientes: para iroN, sitA, feoB, irp-2, iss, ompT y tsh: 94°C por 4 min, seguida de 30 ciclos de, 94°C a 1 min, 59°C a 1 min y 72°C a 2 min. Para ibeA y vat fueron: 94°C por 4 min, 30 ciclos de 94°C a 30 seg, 55°C a 30 seg y 72°C a 1 min. Mientras que para csgA y cvaC: 95°C por 2 min, 30 ciclos de 94°C a 1:30 min, 54°C a 1 min y 72°C a 1.5 min y para el gen fimH fueron: 95°C por 4 min, 30 ciclos de, 95°C a 30s, 57°C a 30s y 72°C a 2 min, en todos los casos con una extensión final de 72°C a 10 min.

Identificación de grupos filogenéticos: Se utilizó el método descrito por Clermont y col (2000)11 que se basa en la presencia o ausencia de la combinación de los genes chuA, yjaA y del fragmento de ADN TspE4C2, los cuales se detectaron por PCR, utilizando oligonucleotidos y condiciones de amplificación descritas por el mismo autor.

Resultados

Los genes de virulencia son codificados mayormente en plásmidos: De los doce genes de virulencia analizados, el 75% fueron detectados en ADN plasmídico y el resto en ADN cromosómico. Los primeros corresponden a ompT, iss, tsh, vat, ironN, sitA, feoB, csgA y cvaC mientras que fimH, ibeA e irp2 se detectaron en el cromosoma.

Frecuencia de genes de virulencia en aislados APEC: Los genes irp-2, iroN, sitA y feoB relacionados con los sistemas de captación de hierro se amplificaron en más del 60% de los aislados, destacando feoB con una frecuencia del 95.6%, en la misma proporción se detectó iss relacionado con mecanismos de resistencia al suero. Los genes de las adhesinas fimbria 1 y curli se detectaron en un 73%, y tsh en un 39%, por su parte la frecuencia de ompT que codifica para la proteasa que actúa contra péptidos antimicrobianos fue del 26%. En menor frecuencia se encontraron a vat e ibeA, el primero fue positivo en el 13% de los aislados, mientras que ibeA relacionado con la formación de biopelículas estuvo presente en el 8%. Finalmente, cvaC gen indicativo de presencia de plásmidos ColV se detectó en un 91%.

Diversidad genética en los aislados APEC: Los genes de virulencia y número de estos varió dependiendo del aislado APEC, en YA15 se determinaron once de los doce genes de estudio, en YA1 diez genes, mientras que YA16 y YA17 presentaron nueve de ellos. El 30% de los aislados portaron ocho genes de virulencia, y 34.8% de los aislados APEC contienen siete genes. Dos aislados tuvieron seis genes de virulencia y un aislado presentó cinco, por último el aislado RS10 presentó solamente dos genes de virulencia correspondiente al 4.3%. Destaca el hecho de que el 64.8% de los aislados presentó entre 7 y 8 de los genes de virulencia analizados (Tabla 1).

Cepa	Irp2	iroN	sitA	feoB	fimH	tsh	csgA	ibeA	iss	vat	cvaC	ompT	No.genes
YA15	+	+	+	+	+	-	+	+	+	+	+	+	11
YA1	+	+	-	+	+	+	+	-	+	+	+	+	10
YA16	+	+	+	+	+	+	+	-	+	-	+	-	9
YA17	+	+	+	+	+	+	+	-	+	-	+	-	9
YA6	-	+	+	+	+	+	+	-	+	-	+	-	8
YA8	-	+	-	+	+	+	+	-	+	-	+	+	8
YA10	+	+	+	+	-	-	+	-	+	-	+	+	8
YA11	+	-	+	+	+	-	+	-	+	-	+	+	8
YA13	+	+	+	+	+	-	+	-	+	-	+	-	8
RS14	+	+	+	+	+	-	+	-	+	-	+	-	8
RS17	+	+	-	+	+	-	+	-	+	-	+	+	8
YA4	-	+	+	+	-	+	-	-	+	+	+	-	7
YA5	+	-	+	+	-	+	+	-	+	-	+	-	7
YA9	-	+	+	+	+	-	+	-	+	-	+	-	7
YA12	-	+	+	+	+	-	+	-	+	-	+	-	7
YA18	-	+	+	+	-	+	-	-	+	-	+	+	7
YA21	+	+	+	+	+	-	-	+	+	-	-	-	7
YA23	+	+	+	+	+	+	-	-	+	-	-	-	7
RS16	+	+	+	+	+	-	-	-	+	-	+	-	7
YA2	-	-	-	+	+	-	+	-	+	-	+	+	6
RS11	-	+	+	+	-	-	+	-	+	-	+	-	6
YA14	-	-	-	+	+	-	+	-	+	-	+	-	5
RS10	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	-	2

Tabla 1 Diversidad genética de 23 aislados APEC en relación a atributos de virulencia.

Grupos filogenético en los aislados APEC: El 8.6% de los aislados son del grupo filogenético A el 34.7% pertenecen al B1, mientras que al grupo B2 correspondió un 34.7% y un 21.7% para el D. El rango de genes de virulencia por grupo filogenético se muestran en la Tabla 2.

Grupo filogenético	Número de aislados	Rango de Genes de virulencia	Promedio de genes de virulencia
A	2	7 a 8	7.50%
B1	8	6 a 8	7.00%
B2	8	7 a 11	8.00%
D	5	2 a 8	6.25%

Tabla 2 Grupo filogenético y genes de virulencia en 23 aislados APEC.

Discusión

La mayoría de los genes de virulencia se detectaron con una frecuencia superior al 50% y se mostró que los aislados tienen una alta variabilidad genética respecto a estos determinantes. fimH se detectó con una frecuencia del 73%, coincidiendo con el 76.6% observado por Ghanbarpour et al. [15]. La frecuencia de la fimbria curli, fue de un 73%, mientras que Maurer et al. [16] lo encontraron en la totalidad de las cepas de estudio y Knobl et al. [17] reportaron una frecuencia del 26%. Tsh ha mostrado capacidad de adherencia a células Caco-2 [18] y la prevalencia de este gen respectivo, ha sido reportado entre 10% y 90% [2,17,19,20]. En este trabajo se detectó en 39% coincidiendo más estrechamente con el 39.5% reportado por Delicato et al. [21]; la discrepancia en la prevalencias reportadas muestran la heterogeneidad de los aislados APEC.

Cabe destacar la alta frecuencia encontrada para los genes relacionados a la captación de hierro, en particular de feoB, este gen que forma parte del sistema Feo el cual tiene como función transportar hierro ferroso y ha sido asociada a la virulencia tanto en E. coli como en Helicobacter pylori, Legionella pneumophila y Campylobacter jejuni [22]. La captación de hierro parecen ser uno de los principales factores de virulencia en cepas APEC, Jeong et al. [23] atribuyen la presencia en APEC de redundantes sistemas de captación de hierro al hecho de que estos pudieran funcionar en los diferentes nichos en el hospedero.

En relación con iss cuya función es mediar la resistencia bacteriana al complemento sérico, Pfaff-McDonough et al. [24] destacaron su importancia en E. coli aislada de aves enfermas (77%), en comparación con el 19% encontrado en aislados de aves sanas. En este trabajo la frecuencia de iss fue del 95%, siendo acorde con lo reportado por Janßen et al. [25] con un 94%, y con el 100% según Kwon et al. [19]. Esta alta frecuencia revela la importancia de función de iss que permite a E. coli evadir las defensas del hospedero, multiplicarse y diseminarse favoreciendo así el desarrollo de la enfermedad.

En este trabajo ibeA fue detectado en un 8% de los aislados, mientras que Rodríguez-Siek et al. [2] y Zhao et al. [26] reportaron una frecuencia de 14.7% y 17% respectivamente. La participación de ibeA en APEC, está relacionada con la formación de biopelículas in vitro y con la capacidad de invasión en cepas APEC, aunque se desconoce el mecanismo exacto por el cual ibeA contribuye al desarrollo de la colibacilosis.

El gen vat en APEC induce la formación de vacuolas intracelulares con efectos citotóxicos similares a los causados por la toxina VacA de Helicobacter pylori. La frecuencia de vat ha sido reportada de 10%, 34% y 95% [19,20,23]; en este trabajo se detectó en un 13% de los aislados. vat se localiza en una PAI y al respecto se ha propuesto a la adquisición de PAIs como el principal mecanismo de la evolución de patógenos, bajo este esquema se podría explicar la diversidad genética de APEC.

La patogenicidad en APEC es multigenético, el número de genes implicados y las combinaciones entre estos es lo que probablemente aumente la virulencia, por lo cual es importante analizar dichas combinaciones y definir así los patotipos moleculares.

Elementos genéticos móviles tales como PAIs y algunos plásmidos contribuyen a la virulencia bacteriana debido a que albergan genes específicos. Aquí se detectó el plásmido ColV en el 91% de los aislados, en otros estudios ha sido reportado del 53 al 67% [2,26,27]. La detección combinada de los genes tsh, iss, iroN y cvaC sugiere la presencia de plásmidos ColV; en este estudio la combinación iss, iroN y cvaC fue del 69.5%, mientras que la de iss, tsh y cvaC disminuyó a un 34.7%, esto pudiera explicarse en función de que iss y iroN junto con otros genes se localizan en la región conservada en los pColV de APEC, en tanto que tsh se localiza en la región variable y está flanqueada por elementos de IS1, lo que sugiere su alta movilidad. Los aislados YA21 y YA2 no presentaron cvaC, pero si las combinaciones iss-iroN o tsh-iss, amplificados a partir de ADN plasmídico, sugiriendo la presencia de plásmidos de virulencia no ColV. La importancia de la presencia de genes de virulencia en plásmidos reside en el desarrollo de nuevas cepas debido a la transferencia de elementos genéticos móviles.

En base a la clasificación filogenética de E. coli, era de esperar que la mayoría de los aislados APEC pertenecieran a los grupos filogenéticos B2 y D, sin embargo destaca que el 34.7% de los aislados derivan del grupo B1, en la misma proporción que para el grupo B2. Además el número de genes de virulencia fue similar en ambos grupos con un promedio de siete genes, lo cual no es acorde con lo descrito para el grupo B1, que alberga principalmente a cepas comensales. En este sentido Zhao et al. [26], reportó que el 40% de los aislados APEC que analizó pertenecen al grupo A, el cual también ha sido clasificado como de cepas comensales e IPEC; de igual forma Jeong et al. [23] encontró altos porcentajes de aislados APEC dentro de los grupos A y B. Bajo este esquema se asume que la clasificación de E. coli en grupos filogenéticos per se, no permite diferenciar las cepas comensales de las cepas ExPEC y sugiere que el origen filogenético de los aislados APEC es diverso.

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