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Key words

T. spiralis, Heat shock protein, Temperature, and pH

Introducción

Las Zoonosis son enfermedades transmisibles entre los animales y el hombre. [1,2] La triquinelosis fue descrita por Owen en 1835, [3] es una enfermedad parasitaria causada por el nematodo Trichinella spiralis, infecta el músculo de prácticamente todos los mamíferos, se ha reportado en casi todo el mundo, su prevalencia es alta en Europa y Asia. La enfermedad en el ser humano, se asocia con la ingesta de carne infectada y sus productos crudos o mal cocidos, sobre todo de cerdo. [4,5,6,7] El ciclo biológico de T. spiralis en mamíferos incluye 3 estadios; adultos, larva recién nacida (LRN) y larva infectante (LI). [4,8]

Se ha observado que T. spiralis sobrevive a cambios ambientales adversos como son una baja de temperatura cuando el animal es sacrificado, cuando la carne infectada es almacenada ya sea por los comerciantes o las amas de casa a 4 y –20°C, además, T. spiralis sobrevive a temperaturas de cocción y freído, y más aún, sobrevive a cambios drásticos de pH en su paso por tracto digestivo del huésped al infectarlo, en el entendido de que no solo tiene una gran capacidad de supervivencia a cambios adversos, sino que presenta una alta infectividad, causando enfermedad.

Por lo anteriormente descrito, nos propusimos analizar las características fisiológicas de T. spiralis que le confiere resistencia para sobrevivir a cambios adversos en su medio ambiente local, principalmente a diferente temperatura y cambios en el pH. Para ello nos enfocamos al estudio de las proteínas de choque calórico (Hsp), que se expresan de manera constitutiva en todas las células tanto procariotas como eucariotas. [9,10,11,12,13,14]

Estas Hsp se sobreexpresan cuando ocurren cambios en el medio ambiente local de las células de todos los organismos tanto inferiores como superiores, es decir, se sobreexpresan en respuesta al estrés. [15,16] Dentro de los estresores que inducen la síntesis de las Hsp están: la hipoglucemia, la anoxia, el calor, el etanol, el peróxido de hidrógeno, iones de metales pesados, arsenicales, infecciones con ciertos virus, [17,18] enfermedades autoinmunes como el lupus eritematoso sistémico, [19] por privación de agua y alimento,[20] radiación ultravioleta, radiación electromagnética de baja frecuencia y los campos intensos de radiación gamma, [21,22] los rayos gamma de baja intensidad, entre otros. [23] La función de las Hsp es proteger a la célula del daño producido por el estrés, mediante la unión a proteínas parcialmente desnaturalizadas, disociando agregados de proteínas y regulando el doblez correcto y la traslocación intracelular de proteínas sintetizadas de novo. [24]

La familia de las Hsp está altamente conservada en todos los organismos. Se han clasificado en seis familias de acuerdo a su peso molecular: a).- Las Hsp de 100-110 kDa, b).- Las Hsp de 83-90 kDa. c).- Las Hsp de 66-78 kDa, d).- Las Hsp de 60 kDa, e). Las Hsp de 40 kDa, f).- Las Hsp pequeñas de 13-25 kDa. [13,14,25,26]

En el contexto fisiológico, las proteínas Hsp juegan un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis celular bajo condiciones normales, como condiciones de estrés. [9,26,27,28] Bajo condiciones normales, las Hsp tienen influencia en la síntesis, transporte y degradación de proteínas; [29,30] bajo condiciones de estrés, actúan como moléculas chaperonas. [31] Cabe señalar que la sobreexpresión de chaperonas moleculares incluyendo miembros de la familia de Hsp70 y pequeñas proteínas de estrés en Drosophila y C. elegans han mostrado que extienden la duración de la vida de estos organismos. Además, recientes estudios han implicado a los factores de shock térmico (HSF) como reguladores de la longevidad. [32,33,34]

Proteínas Hsp en T. spiralis

Se conoce que los parásitos están sometidos a varios estresores impuestos por el huésped; una vez que han penetrado en él, hay condiciones adversas como el calor o ambientes oxidativos que deben ser superados; [35,36] por consiguiente estos parásitos han desarrollado estrategias de supervivencia morfológicas y fisiológicas. Algunos autores indican un importante papel de las Hsp en los cambios morfológicos del parásito y en su resistencia a estresores. [37,38,39,40] La inducción de las Hsp ha sido relacionada incluso con el incremento de la virulencia en algunos parásitos. [41,42]

Las fluctuaciones en el nivel de Hsp están relacionadas con la viabilidad e infectividad de las larvas, ya que en condiciones de estrés, la homeostasis es sostenida a través del incremento en el nivel de Hsp70, cuando se pierde la infectividad, los niveles de Hsp son alterados considerablemente, la homeostasis puede no ser perdida puesto que la viabilidad no decrece. El decremento en los niveles constitutivos de Hsp70 y Hsp90 puede ser un indicador de muerte celular programada conocida como apoptosis. [43] De hecho la inducción de Hsp70 y Hsp90 ha sido asociada con una supresión de apoptosis en muchos estudios. [44,45] Es clara la relación existente entre la reducción en los niveles de Hsp70 y Hsp90 y el decremento de la viabilidad e infectividad de las larvas.

Además, en algunos estudios se ha observado que a temperaturas bajas se reduce el efecto perjudicial del estrés oxidativo; el calor no induce incremento en los niveles de Hsp60/Hsp70 ni reduce la infectividad; incrementos en los niveles de Hsp inducidos por estrés oxidativo pueden causar baja infectividad. [46]

Con respecto a la termotolerancia, a bajas temperaturas Trichinella spp, tiene varias implicaciones, una de ellas es que las LI de todas las especies deben tener una habilidad para resistir la exposición a temperaturas bajas, que ocurre en un huésped infectado después de muerto. De hecho, la biología de la Trichinella y su distribución a nivel mundial sugieren que la LI tiene una tolerancia genéticamente determinada a cambios de temperatura según la región. Hay Trichinella spp típicas de ciertas regiones, por ejemplo, en el ártico T. nativa, en ambiente tropical T. nelsoni, y la T. spiralis, cosmopolita. [47,48]

Las Hsp a pesar de su naturaleza altamente conservada, pueden ser altamente inmunogénicas. [49,50] Por lo anterior y debido a todas sus funciones vitales, las Hsp se utilizan como marcadores de daño por estrés en enfermedades, [51,52,53] en estudios de eficacia de drogas, [54] en estudios ecotoxicológicos, [55] y como constituyente de vacunas. [39] La cuantificación seguida por la comparación de los niveles de Hsp puede ser realizada para todos los organismos y tejidos de donde se puedan obtener biopsias. Esto permitirá el diagnóstico del daño producido por el estrés en el tejido, y en particular durante la infección, pero también permitirá el monitoreo de la progresión o resolución de una parasitosis durante el tratamiento. [52] En un reciente estudio de expresión de Hsp60, Hsp70 y Hsp90 en órganos de ratas con re-infección de Trichinella spiralis, [56] se observó que contrariamente a la infección primaria de las ratas [52] no exhiben ningún aumento en la expresión de Hsp. La insensibilidad de las Hsp en las ratas re-infectadas parece estar relacionado con la inmunidad adquirida. Con lo anterior es probable que las Hsp60, Hsp70 y Hsp90 sean el blanco de la respuesta inmune del huésped en la infección por este nematodo. [50]

En el proceso de infección, las Hsp de los parásitos, juegan un papel central en la adaptación y diferenciación del parásito y en la protección de los mecanismos de muerte del hospedero al parásito, como son metabolitos reactivos y bajo pH. Mas aún, las Hsp del parásito Trichinella y en especial la Hsp70 es conocida como una proteína altamente inmunogénica. [50,57]

Se ha observado que la larva infectante de T. spirals cuando es expuesta a peróxido de hidrógeno (H2O2) y frío, expresa la Hsp50, [58] y al ser expuesta a peroxido de hidrógeno al 1% y 2% se provoca un incremento de las Hsp60, 70 y 90. [59] Cuando T. spiralis es expuesta a 4°C, sobreexpresa la Hsp70, sin cambios en la expresión de la Hsp60 y una disminución de la Hsp90 [60]. Cuando T. spiralis es tratada con antihelmínticos, no se han observado cambios en la expresión de las Hsp60, 70 y 90, salvo para la Hsp50 que disminuye su expresión cuando T. spiralis es tratada con mebendazol. [59]

Por lo anterior, es importante investigar los mecanismos de adaptación del nematodo T. spiralis, debido a que puede infectar a un número variado de huéspedes, por lo que el estudio fisiológico-adaptativo de T. spiralis puede proveer información sobre los mecanismos que ayudan al establecimiento y permanencia de la enfermedad causada por este parásito.

En el presente estudio se determinó, cuales son las Hsp que expresa el nematodo T. spiralis, que le permiten adaptarse a diferentes cambios como son temperatura y pH durante el proceso de implante en un huésped y así causar enfermedad.

El objetivo del trabajo fue: determinar la expresión de las proteínas Hsp25, 60, 70 y 90 cuando el nematodo T. spiralis es sometido a diferente temperatura (40, 21, 4, 0. –20, -50°C) y diferente pH (2, 3, 4, 5, 7, 8, 9).

Material y métodos

Lugar de realización del trabajo: El trabajo se llevó a cabo en el Laboratorio de Biología Celular de la Unidad Académica de Biología Experimental de la Universidad Autónoma de Zacatecas.

Nematodos de T. spiralis. Para mantener la cepa de T. spiralis, se utilizaron ratas Long Evans hembras con una edad promedio de dos meses y medio, con un peso aproximado de 250 gramos. Cada animal fue infectado con 500 LI de T. spiralis por vía oral (trozo de carne infectada)(Xenodiagnóstico). Los animales se mantuvieron en condiciones normales de bioterio.

Obtención de LI por la Técnica de Digestión Artificial: Las LI viables se obtuvieron del músculo de ratas Long Evans infectadas con T. spiralis por seis semanas, las cuales al sacrificarlas, se obtuvo el tejido muscular que fue molido (pierna, masetero, lengua, diafragma e intercostales). Se pesaron 60 gramos de carne y se colocaron en un costal de tela de tul, el cual se introdujo en un embudo de separación para ser sometida a digestión con jugo gástrico artificial, preparado con 1 litro de agua destilada conteniendo pepsina a una concentración de 10,000 U, 3% de HCL 0.2 N (pepsina 3.5 grs. más 7 ml de HCL), teniéndolo en incubación por 24 horas a 37º C para después recolectar el paquete larvario, mismo que fue resuspendido en una solución amortiguadora de fosfatos (PBS; pH de 7.2) (Gibco BRL, Grand Island NY, USA, 21300-58). [61]

Inducción de estrés: El paquete larvario se dividió en 14 partes iguales, 1 como control, 6 fueron sometidas a diferentes temperaturas (-50, -20, 0, 4, 21, 40°C) en medio de cultivo RPMI (Gibco BRL, Grand Island NY, USA, 11875-093), y las otras 7 se estresaron con jugo gástrico artificial a diferente pH (2, 3, 4, 5, 7, 8, 9) todos a un tiempo de 3 horas y a 37°C.

Lisis de los nematodos y PAGE-SDS: Los nematodos de T. spiralis sometidos a estrés a diferente temperatura y diferente pH, se lavaron 3 veces con solución de fosfatos salinos (PBS; pH de 7.2) (Gibco BRL, Grand Island NY, USA, 21300-058), se le añadió 1 ml. de buffer de lisis que contiene: Triton X-100 al 1%, NaCl 140 mM, EDTA 1 mM, Tris-HCl 10 mM pH 7.6 e inhibidor de proteasas 1 mM, PMSF (Sigma Chemical Co, St Louis MO, USA, P-7626). En frío, las larvas en el buffer de lisis se homogenizaron en un mortero. El lisado se centrifugó por 10 minutos a 1600 g y el sobrenadante fue recuperado y se determinó la concentración de proteínas. [62] La cuantificación de proteína se realizó mediante la técnica descrita por Bradford (1976) [63]. De cada condición experimental, 30 μg de proteína se caracterizaron en geles de poliacrilamida (PAGE-SDS al 12.5%) de acuerdo a la técnica descrita por Laemmli (1970). [64]

Western Blot y análisis: Las proteínas en los geles de poliacrilamida-SDS fueron transferidas a papel de nitrocelulosa (Amersham Laboratories, Buckinghamshire, England, RPN303C), como describió Towbin (1979). [65] Después, para identificar a las proteínas Hsp, el blot fue tratado con anticuerpos monoclonales específicos contra las proteínas Hsp25, 60, 70 y 90 (Sigma Chemical Co, St Louis MO, USA, I-1395, T-6674, H-4149, H-5147) con una dilución 1:1000. Un anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado a peroxidasa (Sigma Chemical Co, St Louis MO, USA, A-9044) dilución 1:1500, es usado como segundo anticuerpo, seguido por un sistema de detección quimioluminiscente (ECL, RPN2106, Amersham, Little Chalfont, Buckinghamshire, England), que fue detectado en una película radiográfica BioMax (Eastman Kodak Co, Rochester, NY, USA, 870-1302) en un tiempo de 1 minuto.

Determinación de la cantidad de Hsp: Las autorradiografías obtenidas por el método de ECL se analizaron por densitometría (Eagle Eye, Estratagene Mitsubishi), con el fin de cuantificar la cantidad de proteína. El valor de 21°C fue tomado como condición control de temperatura y 7 el valor control de pH (valor neutro).

Inmunofluorescencia: Las larvas obtenidas por digestión artificial y sometidas a diferente temperatura y pH, se lavaron 5 veces con PBS, bloqueadas con suero fetal bovino (SFB) al 3% en PBS por 30 minutos e incubadas por 1 hora con anticuerpos específicos contra las Hsp25, 60, 70 y 90 (I-1395, T-6674, H-4149, H-5147, Sigma Chemical Co, St Louis MO.) diluidos a 1:500 en 3% de SFB-PB. Después del lavado, la incubación del primer anticuerpo es seguido por el segundo anticuerpo (1:100, F-9137: FITC sheep anti-mouse; Sigma Chemical Co., St Louis MO.) por 1 hora a temperatura ambiente. Después de 5 lavados con PBS, las larvas fueron colocadas en portaobjetos, se les colocó un cubreobjetos y se analizaron por microscopía confocal (Carl Zeiss, Axiovert 200M).

Análisis estadístico: Las bandas de proteína Hsp25, 60, 70 y 90 obtenidas bajo las condiciones de estrés por temperatura y pH que fueron analizadas por densitometría, los resultados obtenidos fueron expresados como media ± s.e.m., donde n es el número de observaciones.

Discusión

En nuestra investigación, las larvas infectantes de T. spiralis fueron expuestas a varios estresores, simulando los impuestos por el mismo huésped o bien, por el manejo de la carne desde el sacrificio de un animal infectado hasta su almacenamiento. Lo anterior se justifica debido a que T. spiralis sobrevive a cambios adversos de temperatura por almacenamiento o cocción, y variaciones en el pH durante el paso por tracto digestivo de un huésped, y así causar enfermedad.

En el presente estudio se analizaron las proteínas de choque calórico (Hsp) que expresa el nematodo T. spiralis, y que de manera fisiológica le permiten adaptarse a cambios como son temperatura y pH durante el proceso de implante en un huésped, causando enfermedad, por lo que el objetivo del presente trabajo fue: determinar el grado de expresión de las proteínas Hsp25, 60, 70 y 90 cuando el nematodo T. spiralis es sometido a diferente temperatura (40, 21, 4, 0. –20, -50°C) y diferente pH (2, 3, 4, 5, 7, 8, 9). El analizar cambios en el pH es debido a que en el tejido infectado se tiene un pH y al ser ingerido por un huésped a lo largo del tracto digestivo se presentan diferentes pH.

Al analizar por Western blot a las proteínas Hsp constitutivas de T. spiralis a temperatura ambiente (21°C), encontramos que expresa en mayor proporción la Hsp25, le sigue la Hsp90, y en menor cantidad la Hsp70. Es normal haber encontrado la expresión de algún miembro de la familia de las Hsp en T. spiralis, ya que se conoce que se expresan prácticamente en todas las células vivas, tanto procariotas como eucariotas y que tienen funciones esenciales bajo condiciones de desarrollo normal como es el plegado correcto de proteínas durante su síntesis, transportar de un compartimiento subcelular a otro y ayudar en la degradación de proteínas entre otras funciones. [9,13,14,15,66] Bajo esta condición experimental, no se encontró la expresión de la Hsp27 y 60.

La localización de las Hsp25, 70 y 90 analizada por inmunofluorescencia utilizando microscopía confocal, fue de manera homogénea en esófago, cavidad celómica y cutícula para la Hsp25; la localización de Hsp70 fue homogénea principalmente en esófago y cutícula; y la Hsp90 la encontramos homogénea principalmente en cavidad celómica.

Al estresar T. spiralis a diferentes temperaturas y analizar cambios en la expresión de las Hsp, encontramos que existe un incremento de la Hsp25 conforme T. spiralis se somete a bajas temperaturas (4, 0, -20, -50), en cambio a altas (40°C), se reduce su expresión. Lo anterior corresponde con lo reportado en organismos multicelulares, donde las smHsp son las proteínas de estrés calórico que más se induce su expresión por condiciones estresantes, pero también están sujetas a la expresión regulada durante el desarrollo en ausencia de estrés, demostrado en estudios de Drosophila. [67]

En el presente estudio, la sobreexpresión de la Hsp70 se da por calor (40°C) o por frío (-50°C). Se ha reportado que la Hsp70 se encuentra en todos los organismos estudiados, desde bacterias, levaduras y el hombre, localizadas de manera ubicua en las células, cuya función principal es en el transporte y la unión a proteínas desdobladas y su corrección. [68] Durante el estrés por calor u otro tipo de estresores, la Hsp70 es una proteína inducible, ayudando al plegado correcto de proteínas parcialmente desnaturalizadas, y disociando agregados de proteínas. [13,14] La Hsp70 fue la primera proteína observada como inducible por estresores como el calor entre otros. [13] Además, se ha encontrado que durante el choque térmico se protege selectivamente a las mitocondrias con una correlación estrecha entre el grado de protección mitocondrial y la concentración de Hsp70. [69] Esta protección es confirmada en ratas expuestas a choque térmico previo a una perfusión cardiaca con peróxido de hidrógeno, donde provocó aumento en la concentración de Hsp70. [36]

En el presente estudio, el comportamiento de la Hsp90 es sobreexpresarse ya sea por frío o por calor, y entre sus funciones se ha encontrado que ayuda a prevenir el agrupamiento de otras proteínas que están desplegadas debido a incrementos en la temperatura u otro tipo de estresor, también se asocia a componentes celulares como los receptores de hormonas esteroideas, [70] así mismo juega un papel crucial en la regulación de enzimas y trascripción de proteínas dentro de la célula. [71]

Uno de los hallazgos mas relevantes de la presente investigación fue que bajo la condición experimental de –50°C, aparece la expresión de la Hsp60. Mencionamos antes el papel que juegan la Hsp70 y Hsp90 en el doblado de proteínas en células sometidas a estrés, lo que junto con la expresión de la Hsp60 y la Hsp10, ayuda bajo las mismas condiciones a la supervivencia celular, ya que funciona como chaperona que facilita el doblado y renaturalización de proteínas en células sometidas a estrés, así mismo, su función a nivel mitocondrial es en el transporte de proteínas, en donde la Hsp60 y Hsp70 facilitan el tráfico bidireccional entre la mitocondria y el citoplasma, sin dejar de mencionar su función en la respuesta inmune, ya que la Hsp60 tiene propiedades inmunodominantes, [67] siendo todas estas características un punto importante en la ayuda para contrarrestar el estrés.

La expresión de las Hsp por cambios de temperatura fue analizado por inmunofluorescencia utilizando microscopía confocal, con el propósito de analizar posibles cambios en la localización de las Hsp en T. spiralis. En general, se encontró que la localización de la Hsp es homogénea en esófago, cavidad celómica y cutícula cuando tenemos temperatura de 21°C, y conforme se disminuye la temperatura, este patrón llega a ser a lo largo del parásito de manera homogénea, difusa y de puntilleo.

Así mismo, al analizar por Western blot la expresión de las Hsp cuando T. spiralis es sometida a diferente pH, encontramos que las Hsp25, 70 y 90 se expresan a diferente pH, donde las Hsp25 y 70 se sobreexpresan a un pH tanto ácido como básico, mientras que la Hsp90 solamente se sobreexpresa a un pH ácido y disminuye su expresión a un pH básico. La distribución de las Hsp bajo las condiciones estresantes de pH es a lo largo de todo el nematodo similar a la encontrada a temperatura ambiente de 21°C.

Podemos concluir, que los nematodos sobreviven a cambios bruscos de temperatura y pH ayudados por la expresión de cuatro proteínas del estrés calórico, la Hsp25, 60, 70 y 90, y otras proteínas aún no caracterizadas.

Es importante hacer un análisis más profundo sobre los mecanismos que utiliza T. spiralis para implantarse en un huésped y causar enfermedad. Los aspectos más importantes de nuestro estudio, es acerca de la supervivencia del nematodo a temperaturas extremas y a cambios en el pH.

Es crucial seguir estudiando sobre los mecanismos de adaptación y supervivencia de este nematodo debido a la expresión y sobreexpresión de las proteínas de estrés calórico, así como analizar la variación de estas proteínas durante diferentes procesos de preacondicionamiento a estresores como la temperatura y variaciones en el pH, junto o en paralelo con los de evasión de la respuesta inmune del huésped.

Agradecimientos

Apoyo del CONACYT. Dr. Sergio Hugo Sánchez Rodríguez. Contrato: 499100-5-I31456-N.

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